“一键合成”｜从DNA到膜蛋白

更新时间：2024-12-06 点击次数：845

膜蛋白在细胞表面的特定位置具有特定功能，其在生理功能（比如说营养吸收、信号转导、有毒物质的去除等等）和病理过程（如癌症发展、病原体入侵等等）中发挥着重要作用，也是理想的药物靶点。膜蛋白表达在生物学和医学领域具有极其重要的地位，但同时也面临着诸多挑战和瓶颈。

一、膜蛋白表达的重要性及瓶颈

1. 重要性

1.1物质运输与信号传导：膜蛋白作为细胞膜的主要成分，负责物质的跨膜运输和细胞内外信号的传导。

1.2细胞识别与免疫应答：膜蛋白还参与细胞的识别过程，作为细胞表面的标志物，能够与其他细胞或分子相互作用。

1.3药物靶点与疾病治疗：膜蛋白承担了生物膜的主要功能,是新药研发最重要的靶点群,大约60%的药物以膜蛋白为靶点。

2.瓶颈

2.1表达效率低：由于膜蛋白复杂的结构和疏水性，使得它们在细胞内的表达往往受多种因素的限制，从而导致表达效率低下。

2.2纯化困难：膜蛋白与细胞膜紧密结合，难以通过传统的蛋白质纯化方法获得高纯度的目标蛋白。

2.3稳定性差：由于膜蛋白在水溶液中有明显的聚集和变性倾向,在体外很难模拟维持膜蛋白正确构象的类膜环境,导致膜蛋白的结构和功能以及相关配体药物的研究远远滞后于水溶性蛋白。

2.4功能验证困难：由于膜蛋白的功能往往与其在细胞膜上的定位和相互作用密切相关，传统的验证手段很难在体外准确地验证其功能。

图1.膜蛋白在生物体内合成途径

综上所述，膜蛋白表达在生物学和医学领域具有不可替代的作用，但同时也面临着诸多挑战和瓶颈。为了克服这些困难，研究者们正在不断探索新的表达系统和纯化方法，以期提高膜蛋白的表达效率和纯度，为疾病治疗和药物研发提供更有力的支持。其中，无细胞蛋白表达技术（Cell-Free Protein Synthesis, CFPS）因其优势，在膜蛋白表达领域展现出巨大的潜力。

二、CFPS技术在膜蛋白表达上的应用

2.1 概述

CFPS技术是一种在体外实现DNA到蛋白质转录翻译过程的技术。它利用来源于细胞的转录翻译元件，在体外构建能够直接从DNA合成蛋白质的反应体系。这种技术摆脱了细胞的束缚，具有快速、灵活、可控和易于优化的特点。

在膜蛋白表达中，CFPS技术能够显著提高表达效率，通过优化反应条件和添加特殊配置的辅助分子试剂，实现膜蛋白的高效合成。同时，由于无细胞体系不含有复杂的细胞成分，因此可以简化膜蛋白的纯化过程，提高纯度和回收率。此外，无细胞体系还能够提供适宜的反应条件，如温度、pH值和离子强度等，有助于维持膜蛋白的天然构象和稳定性。更重要的是，CFPS技术为膜蛋白的功能验证提供了有力支持。通过构建细胞膜模型，利用脂质体或合成细胞膜模拟细胞膜环境，研究者可以在体外观察膜蛋白的活性、转运速率和信号传导能力等，从而验证其功能。这种方法不仅避免了细胞内复杂环境的干扰，还提高了功能验证的准确性和可靠性。

2.2 应用场景

生产嗅觉受体蛋白

嗅觉受体蛋白是一类典型的膜蛋白,属于G蛋白偶联受体家族，可以直接识别气味分子,将生物信号转化为电信号，最终传递至神经中枢，调控着生物的食物寻找、危险趋避和求偶行为。但是传统的膜蛋白获取方法并不容易。天然组织中的膜蛋白含量太低不足以支撑学术研究。李剑勇等人选取Canton-S果蝇的嗅觉受体蛋白OR83b、OR7a和OR42a作为研究对象，探索用于膜蛋白表达的无细胞表达体系.成功表达出嗅觉受体蛋白质OR83b、OR7a和OR42a，最高表达量达到313 mg/L，实现了膜蛋白的高效表达。

图2：OR83b和OR42a的可溶性表达

制备病毒体

siRNA治疗应用的困难在于缺乏安全有效的输送载体，而病毒体作为一种由脂质膜和膜蛋白组成的纳米囊泡，它保留了没病毒遗传物质的融合蛋白，因此与病毒载体相比，免疫原性较低。然而传统的病毒体制备过程很繁琐，涉及洗涤剂溶解病毒膜蛋白，离心去除病毒核酸，最后进行脂质自组装。此外，使用洗涤剂可能会破坏膜蛋白的结构和功能完整性，且脂质体自组装过程无法确保药物的有效封装。Wang Y等人使用CFPS技术，在体外合成HA2蛋白，且在一步反应中制备HA2病毒体，并成功实现了siRNA的输送。与Leci脂质体相比，HA2病毒体表现出更高的siRNA输送效率和VEGF基因沉默效率。

图3：病毒体的表达及运输

上述应用场景只是CFPS技术在膜蛋白表达领域的冰山一角，它通过优化表达条件、简化纯化过程和提高稳定性，为解决膜蛋白表达和纯化过程中的瓶颈问题提供了新的途径。为膜蛋白的结构研究、功能验证和药物研发提供了有力支持。随着技术的不断进步和应用领域的拓展，CFPS技术有望在膜蛋白表达领域发挥更大的作用，为生物医学研究和药物开发做出更大的贡献。

珀罗汀生物依托自主研发的无细胞蛋白表达平台，已成功实现对膜蛋白的高效快速合成，成为膜蛋白表达的救星。

参考文献

Guan L. The rapid developments of membrane protein structure biology over the last two decades. BMC Biol. 2023;21(1):300. Published 2023 Dec 29. doi:10.1186/s12915-023-01795-9.
方家豪,曹雨虹,何宇臻,洪战英,柴逸峰.膜蛋白稳定技术及其在药物筛选中的应用进展[J].药学学报,2021,56(9):前插1-前插2,2325-2334.DOI:10.16438/j.0513-4870.2021-0573.
李剑勇,满亚辉,陈倩,裴迪,吴文健.膜蛋白的表达：在无细胞体系中实现功能性表达、折叠和组装[J].生物化学与生物物理进展,2018,45(4):389-400.
Wang Y, Jin B, Li B, et al. Cell-free protein synthesis of influenza virus hemagglutinin HA2-integrated virosomes for siRNA delivery. Int J Pharm.2022;623:121890. doi:10.1016/j.ijpharm.2022.121890.