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非天然氨基酸（ncAAs）是一类不受遗传密码子约束的特殊氨基酸，它们具有空间构型和化学性质，通过将它们精准地结合到蛋白质中，我们可以为蛋白质赋予新的化学、物理和生物活性。近年来，随着生物技术和医药领域的快速发展，非天然氨基酸在生物学研究、药物开发以及医学诊断等方面展现出巨大的应用潜力。无细胞蛋白质表达(CFPS)作为一种创新的蛋白质表达平台，极大的促进了人工蛋白质的表达，通过整合ncAAs，开发了许多灵活的方法，可显著提高ncAAs的整合效率。
今天就和大家分享Front Bioeng Biotechnol期刊上名为“Emerging Methods for Efficient and Extensive Incorporation of Non-canonical Amino Acids Using Cell-Free Systems"的文献。
一、研究背景
无细胞蛋白质合成（CFPS）已成为在特殊应用中生产重组蛋白质的有效方法。通过消除细胞膜屏障和细胞活力约束，CFPS比体内蛋白质表达有明显的优势：1.CFPS的开放性，使得研究人员可以精确地操纵系统中分子；2.无需考虑细胞活性，有毒试剂和难以表达的蛋白质可以在CFPS中使用，甚至可以应用一些没有生物相容性的反应条件；3.无需使用活细胞，生物安全可以得到保证。因为CFPS系统的这些特点让其在ncAA整合中也具有显著优势，包括能处理有毒ncAAs、简化后续反应流程以及避免细胞内整合的限制等。
然而ncAAs在CFPS中的整合过程会受到内生竞争影响，为了精确合并ncAAs，需重新分配特殊密码子。虽然研究人员已对终止密码子和有义密码子进行了重新分配，但ncAAs复合物与内源性生物分子间的密码子竞争仍会导致蛋白质错误或截断。
图1:CFPS系统制备和ncAAs合并中的内源竞争的示意图
二、消除竞争的策略
密码子的竞争，会严重影响ncAAs整合的效率。目前，消除竞争的方法包括基因组工程、蛋白质消除、tRNA操作和氨基酸替代。
图2:消除ncAAs竞争的不同策略
1.基因组工程
在蛋白质合成过程中，琥珀密码子（UAG）通常被肽链释放因子1（RF1）识别作为翻译终止的信号。然而，通过基因组工程，研究人员可以重新分配UAG的功能，使其能够编码ncAAs。这种策略的一个关键步骤是删除编码RF1的prfA基因，通过删除该基因，RF1的表达被抑制，从而减少了RF1与UAG的结合，使UAG能够被ncAAs的转运RNA（tRNA）识别并插入对应的ncAAs。这种方法在多种生物系统中均被证明是有效的，为ncAA的精确插入提供了可能。
2.蛋白质消除策略
由于开放式反应环境可以直接控制，CFPS系统相比于体内翻译系统更灵活。各种消除竞争策略只有在CFPS系统中才有可能。其中从CFPS系统中消除蛋白质的竞争是一个重要的消除策略，通过操纵蛋白质水平来保持对细胞生长至关重要的蛋白质活性，同时从CFPS系统中去除可能产生竞争的蛋白质。
CFPS系统中的蛋白质消除策略对于提高蛋白质合成效率和控制产物纯度至关重要。通过选择性去除或失活特定蛋白质，如RF1，可以优化CFPS系统的性能，并促进nAAs的插入，从而扩展蛋白质的功能和应用范围。这些策略的实施依赖于基因工程和蛋白质工程的进展，以及针对特定蛋白质的定制化消除方法的开发。
3.tRNA的操作
当ncAAs以有义密码子插入蛋白质时，内源性氨基酰-tRNA将在翻译过程中与核糖体中的ncAA氨基酰-tRNA竞争，从而产生部分天然蛋白质。直接操作细胞中的tRNA是不现实的，但在没有膜屏障的CFPS中操纵是很方便，通过操纵tRNA释放大量有义密码子用以插入ncAAs。考虑到tRNA和密码子之间的一对一对应，人工密码子表，甚至最小密码子组合都可以通过CFPS中的tRNA操纵来实现。
4.替换氨基酸
在生物合成过程中ncAAs的插入提供了一种在蛋白质中引入新特性的方法。然而，由于天然氨酰tRNA合成酶（aaRS）对氨基酸的特异性较为宽松，少数结构上与标准氨基酸相似的ncAAs能够被对应的aaRS识别并装载到原生的tRNAs上。这些结构相似的ncAAs可以替代相应的标准氨基酸在蛋白质中发挥作用。一种称为“氨基酸替换CFPS"的方法，作为ncAA整合策略的一种成本效益高且简单的替代方案，不需要改造aaRS或tRNAs。
三、CFPS的新型ncAAs和体外氨基酰化方法
在新型ncAAs方面，研究人员通过化学合成和基因工程手段，设计和合成了大量具有特定功能的ncAAs。这些ncAAs通常带有特殊的化学基团，如荧光基团、生物正交反应基团等，这使得它们能够在不干扰内源性生物过程的同时，赋予蛋白质新的功能或特性。
图3:新型ncAA仅用于CFPS
在体外氨酰化方法方面，可通过优化氨酰化反应条件、开发新型氨酰化酶或氨酰化试剂等，使得ncAAs能够高效、准确的整合到蛋白质中。这些方法的开发不仅提高了CFPS中ncAAs的整合效率，还扩大了可用于CFPS的ncAAs的种类和范围。
图4:体外氨基酰化方法与CFPS相结合
四、总结
CFPS作为设计遗传密码的强大平台，特别是其高效整合ncAAs的能力，可以通过基因组工程、肽释放因子消除、tRNA操作和氨基酸替代等多种策略来优化人工蛋白质的合成效率和产量。这些策略使得多个密码子可以被重新分配给不同的ncAAs，无需内源性竞争，为人工蛋白质合成提供了更大的灵活性。CFPS在多个新兴领域如抗体药物、蛋白质标记和肽基材料中的应用潜力巨大，特别是在酶活性改善方面的潜力，例如通过ncAAs的整合来模拟或增强酶的磷酸化、甲基化等关键修饰。研究人员可以通过选择合适方法，将CFPS高效整合ncAAS中，并激发ncAAs技术和应用的未来突破。
综上所述，CFPS在ncAAs方面具有广阔的应用前景。随着技术的不断发展和完善，CFPS结合ncAAs将在药物研发、材料科学、生物学研究和合成生物学等领域发挥越来越重要的作用。
目前珀罗汀生物基于自研无细胞蛋白表达（CFPS）平台，推出非天然氨基酸定点插入蛋白表达服务！这标志着珀罗汀生物成为可以提供基于自主知识产权的CFPS系统，进行非天然氨基酸定点插入相关的设计、服务、生产解决方案供应商！
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